NF-κB经典激活通路在免疫应答、炎症反应、细胞增殖、凋亡调控及肿瘤发生中发挥核心调控作用。该通路的关键抗体如NF-κB p65（RelA）、Phospho-IκB-α (Ser32/Ser36)、IκB-α、p50等是相关研究中的常用工具。然而，研究者在实际WB实验中常面临以下共性挑战：

分子量多样性：通路中不同蛋白分子量跨度大（如NF-κB p65 ~65 kDa，Phospho-IκB-α ~40 kDa，IκB-α ~39 kDa），单一电泳条件难以兼顾。

翻译后修饰干扰：磷酸化（如p-IκB-α Ser32/Ser36）或泛素化修饰易导致条带迁移异常或出现多条带，IκB-α磷酸化后迅速降解，窗口期极短。

丰度差异显著：总蛋白与活化/入核形式丰度差异大，低丰度磷酸化蛋白（如p-IκB-α）检出困难，刺激后迅速降解导致检测窗口窄。

非特异性条带：部分抗体与家族同源蛋白（如NF-κB p65 vs RelB）或骨架蛋白交叉反应。

WB应用测评设计

测评维度：

本次测评我们选取该通路中的2个核心指标进行平行测试：

NF-κB p65（总蛋白，~65 kDa）

Phospho-IKBα (Ser32/Ser36)（活化形式，~35-40 kDa）

指标：NF-κB p65

对比品牌：

主流品牌：Abcam、CST

国产品牌：优品生物

指标：Phospho-IKBα (Ser32/Ser36)

对比品牌：

主流品牌：Abcam、CST

国产品牌：优品生物

关键结论

高特异性：优品生物两款抗体在对应细胞中正确表达，且与家族同源蛋白无明显交叉反应，背景洁净。

关键指标媲美进口品牌：在特异性、灵敏度（最低检出限可达10-20 μg总蛋白）及背景控制上，优品生物表现与进口品牌持平。

分子量验证可靠：检测到的NF-κB p65（~65 kDa）及Phospho-IκB-α (Ser32/Ser36)（~40 kDa）条带位置与预期一致，无异常偏移。

更具性价比：以进口品牌30-50%的价格提供同等甚至更优的检测效果，尤其适合通路多指标联合检测。

实验方案优化建议（针对NF-κB经典激活通路WB痛点）

优品生物基于数千次通路WB实验经验，提供以下优化方案：

1. 样本制备：

使用RIPA（含SDS）强裂解液提取总蛋白，如需检测核内NF-κB p65，建议使用核蛋白提取试剂盒。

必须添加磷酸酶抑制剂（PhosSTOP）和蛋白酶抑制剂，防止去磷酸化引起的分子量变化；检测p-IκB-α时建议额外添加新鲜配制的NaF和Na₃VO₄。

磷酸化检测需进行刺激处理（如TNF-α或LPS刺激5–30 min），并快速收样，避免IκB-α降解导致信号丢失。

2. 电泳条件：

NF-κB p65（~65 kDa）与Phospho-IκB-α（~40 kDa）可使用10-12% SDS-PAGE，100 V恒压电泳120分钟。

如需同时检测总IκB-α与磷酸化形式，建议使用梯度凝胶（4-12%）改善分离效果。

磷酸化蛋白建议使用Phos-tag凝胶或添加磷酸酶处理对照，以验证条带特异性。

3. 抗体孵育：

推荐稀释比：NF-κB p65 (1:2000)、Phospho-IκB-α (Ser32/Ser36) (1:1000)，5% BSA封闭，4℃过夜孵育。

磷酸化抗体建议使用5% BSA封闭，避免使用脱脂奶粉（含酪蛋白磷酸化位点可能干扰）。

4. 问题排查：

若NF-κB p65出现50-55 kDa非特异性条带，建议更换封闭液或提高一抗稀释比。

若Phospho-IκB-α出现多条带，可能为其他磷酸化位点交叉反应，建议使用λ磷酸酶处理样本验证，或更换抗体批次。

若p-IκB-α信号极弱，建议优化刺激时间（TNF-α 5-15 min）并增加上样量至40-60 μg。

用户真实反馈

案例1（炎症信号研究，NF-κB p65检测）

案例2（肿瘤炎症微环境，多指标联合）

优品生物NF-κB经典激活通路抗体系列（覆盖总蛋白、活化形式及下游效应分子）均通过KO细胞验证+多批次测试+低丰度检出的专项验证体系。我们不仅提供单抗体，还可定制通路多指标WB检测方案。欢迎提交您的样本进行免费试用或个性化测评需求。

产品列表