摘要

目的:天然产物（NPs）历来是药物研发的核心来源。然而天然产物结构复杂，精准确定其生物活性成分及作用靶点仍面临巨大挑战。本研究建立一种创新的天然产物虚拟筛选 - 相互作用 - 表型（NPVIP） 研究策略，整合虚拟筛选、化学蛋白质组学与代谢组学技术，用于天然产物生物活性靶点的鉴定与验证。该方法可降低假阳性结果，提升靶点鉴定效率。

方法：本研究以对缺血性脑卒中（IS）具有明确治疗潜力的中药丹参（Salvia miltiorrhiza，SM）为例，展示该策略的完整流程。通过虚拟筛选、化学蛋白质组学、代谢组学分别筛选得到丹参治疗缺血性脑卒中的潜在靶点29 个、100 个、78 个。经 NPVIP 策略进一步分析，最终确定5 个高可信度靶点，包括：多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1（PARP1）、信号转导与转录激活因子 3（STAT3）、淀粉样前体蛋白（APP）、谷氨酸 - 氨连接酶（GLUL）及谷氨酸脱羧酶 67（GAD67）。后续验证实验证实，这些靶点在丹参的神经保护作用中发挥关键作用。

结论：本研究不仅证实丹参在缺血性脑卒中治疗中的重要价值，更为天然产物研究提供了可推广的整合式研究范式，该方法可广泛应用于其他药理学探索。

关键词：NPVIP 策略；靶点鉴定；天然产物；丹参

核心内容

本研究提出的天然产物虚拟筛选-相互作用-表型标准工作流程主要包括以下关键步骤：

天然产物的提取与表征：以丹参为例，通过75%乙醇提取、硅胶柱色谱分离，并结合超高效液相色谱-串联质谱和全球天然产物社会分子网络等技术，对丹参提取物的化学成分进行了全面分析，共鉴定出151种化合物，这是迄今最全面的丹参化学成分表征之一。

药效验证：通过体外PC12细胞的氧糖剥夺/复糖复氧模型和体内大鼠大脑中动脉闭塞模型，证实了丹参提取物对缺血性脑卒中具有显著的神经保护作用，包括提高细胞活力、维持钙稳态、保护线粒体结构、减少脑梗死体积和改善神经功能评分。

虚拟筛选：利用丹参已知的化学成分，通过基于结构相似性（如SwissTargetPrediction）和生物活性相似性（如Chemical Checker平台）的工具进行靶点预测。整合两种方法的结果，并与疾病数据库（DisGeNET）中缺血性脑卒中相关靶点取交集，最终获得29个高置信度潜在靶点。进一步的富集分析、蛋白互作网络分析和分子对接揭示了这些靶点参与的通路（如炎症反应、花生四烯酸代谢）以及核心蛋白（如APP、STAT3）。

化学蛋白质组学分析：采用蛋白质组积分溶解度改变方法，这是一种基于细胞热迁移测定的简化方法，用于识别与丹参提取物直接结合的蛋白。将细胞裂解液与丹参提取物孵育后，施加温度梯度处理，通过质谱鉴定和定量热稳定性发生变化的蛋白。共筛选出100个差异蛋白，其中86个热稳定性显著增加，包括在虚拟筛选中也鉴定到的APP。这些蛋白富集于自噬通路和突触后膜等功能。

多剂量代谢组学分析：对经不同浓度丹参提取物处理后的细胞进行非靶向代谢组学分析。通过分析随剂量变化的代谢物，推断其上游或下游的代谢酶靶点。共鉴定出82个剂量依赖性变化的代谢物，关联到78个代谢酶靶点。例如，发现丹参提取物可能通过影响谷氨酸-氨连接酶和谷氨酸脱羧酶67调节谷氨酸和γ-氨基丁酸的水平，从而缓解兴奋性毒性。

核心发现与验证

通过整合虚拟筛选、化学蛋白质组学和代谢组学的分析结果，并结合生物信息学分析，本研究筛选出五个高置信度靶点进行实验验证：

聚ADP核糖聚合酶1

信号转导和转录激活因子3

淀粉样前体蛋白

谷氨酸-氨连接酶

谷氨酸脱羧酶67

采用药物亲和力响应靶点稳定性技术结合Western blot实验证实，丹参提取物能够以剂量依赖的方式增强这五种蛋白抵抗蛋白酶消化的能力，表明丹参中的活性成分与这些蛋白存在特异性结合。进一步的分子对接和分子动力学模拟（图9E）也验证了丹参中特定化合物（如芹菜素与APP、 Salvianolic acid C与PARP1等）与这些靶点蛋白之间的稳定结合。

讨论与总结

本研究成功展示了天然产物虚拟筛选-相互作用-表型策略在识别天然产物（丹参）治疗复杂疾病（缺血性脑卒中）的多靶点机制方面的有效性。该方法整合了计算模拟、直接相互作用验证和表型相关分析的优点，弥补了单一方法的不足，显著提高了靶点发现的准确性和效率。通过该方法识别并验证的五个靶点——聚ADP核糖聚合酶1、信号转导和转录激活因子3、淀粉样前体蛋白、谷氨酸-氨连接酶和谷氨酸脱羧酶67，在缺血性脑卒中的病理过程中（如细胞死亡、凋亡、应激反应、兴奋性毒性等）均扮演着关键角色，为丹参的神经保护作用提供了新的分子机制见解。该研究不仅为丹参的临床应用提供了重要依据，也为其他复杂天然产物的药理学研究提供了一个可借鉴的综合范式。尽管存在将混合物视为整体而难以明确特定成分-靶点关系的局限性，但结合分子对接和动力学模拟等手段可在一定程度上进行弥补，未来亦可整合表面等离子体共振和超滤液质联用等技术进行更深入的探究。

未来研究

一、明确成分-靶点对应关系
当前将丹参提取物作为整体分析，难以确定具体化合物与靶点的对应关系。后续可利用表面等离子体共振等技术，对PARP1、STAT3等核心靶点与丹参单体进行一对一结合验证。

二、解析多靶点协同机制
通过基因编辑技术逐一敲除靶点，评估各靶点在神经保护中的贡献度，揭示PARP1、APP等靶点间的信号串扰网络。

三、拓展方法应用
将NP-VIP策略应用于黄芪、人参等其他天然产物，研究其在神经退行性疾病、肿瘤中的作用机制。

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IF6.1

文章标题

Natural Product Virtual-Interact-Phenotypic Target Characterization: A Novel Approach Demonstrated with Salvia Miltiorrhiza Extract

作者：

Rui Xu , Hengyuan Yu , Yichen Wang, BoyuLi , Yong Chen, Xuesong Liu,Tengfei Xu

DOI：

10.1016/j.jpha.2024.101101

发表期刊：

Journal of Pharmaceutical Analysis

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