发布时间：2026-07-03
背景： 抗菌肽作为宿主自身的抗菌来源，是开发新型抗菌剂的重要候选分子。本研究从多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）中鉴定并分析了LEAP-2基因（命名为OmLEAP-2），并通过体内和体外实验评估其抗菌活性。
方法：OmLEAP-2编码92个氨基酸，具有疏水表面（LAMMPWY基序）和两个二硫键。在嗜水气单胞菌（A. hydrophila）感染后，多鳞白甲鱼的肝脏、脾脏和肠道中OmLEAP-2表达上调。重组OmLEAP-2蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出剂量依赖性的抗菌活性，尤其对嗜水气单胞菌和维罗尼气单胞菌（A. veronii）效果显著。
结果： 过表达OmLEAP-2不仅能降低细菌负荷、提高感染后的存活率，还能抑制TNF-α和IL-1β的表达。此外，OmLEAP-2通过增加肝脏铁含量、改变血清铁水平以及调节铁代谢相关基因（fpn1和hepcidin）的表达，调控铁代谢。综上所述，OmLEAP-2具有广谱抗菌活性，是治疗细菌性疾病的潜在候选肽。
关键词： 抗菌肽，多鳞白甲鱼，抗菌免疫，LEAP-2
核心内容：
本研究从国家二级保护动物多鳞白甲鱼中鉴定出一个新型抗菌肽基因OmLEAP-2，并系统验证了其抗菌功能与机制。
一、结构与表达：OmLEAP-2编码92个氨基酸，含两个二硫键和疏水表面（LAMMPWY基序），主要在肝脏表达，脾脏和肠道次之。嗜水气单胞菌感染后，肝、脾、肠中表达显著上调。
二、抗菌活性：重组OmLEAP-2对革兰氏阴性菌（尤其气单胞菌）抑制效果优于革兰氏阳性菌，对嗜水气单胞菌和维罗尼气单胞菌的效果与氨苄青霉素相当。
三、双重杀菌机制：①破坏细菌细胞膜完整性，导致内容物泄漏和细胞变形破裂；②直接降解细菌基因组DNA，阻断其复制增殖。
四、体内验证：过表达OmLEAP-2可显著降低组织细菌负荷、提高感染后存活率；感染前上调TNF-α和IL-1β（增强免疫准备），感染后抑制过度炎症（避免免疫损伤），体现双向免疫调节功能。
五、铁代谢调控：OmLEAP-2过表达增加肝脏铁含量，上调铁代谢关键基因hepcidin和fpn1，提示其通过调控铁死亡通路间接影响铁稳态。
核心机制流程
实验动物：健康多鳞白甲鱼（平均体长13.7 ± 0.50 cm）购自陕西天源生态农场，在循环水养殖系统中适应性饲养三周。
基因克隆与生物信息学分析：从肝脏转录组中鉴定出OmLEAP-2基因。使用SignalP 5.0预测信号肽，SMART分析保守结构域，Expasy计算理化性质，MEGAX构建系统发育树。
组织分布与感染实验：收集健康鱼的肝、脾、肠、肌肉、心脏、鳃、脑和肾。感染组腹腔注射100 μL嗜水气单胞菌悬液（1.0 × 10⁷ CFU/mL），对照组注射等量PBS，在0、3、6、12、24小时采集肝脏、脾脏和肠道样本。
RT-qPCR：检测OmLEAP-2、TNF-α、IL-1β、hepcidin和fpn1的mRNA表达水平。β-actin和GAPDH为内参基因。
原核表达与纯化：将OmLEAP-2 ORF克隆至pET-28a质粒，转化E. coli BL21，0.4 mM IPTG诱导表达，Ni树脂纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。
抗菌活性测定：选择4种革兰氏阴性菌（嗜水气单胞菌、维罗尼气单胞菌、大肠杆菌、副溶血弧菌）和2种革兰氏阳性菌（无乳链球菌、金黄色葡萄球菌），与不同浓度OmLEAP-2（25、50、100 μg/mL）共孵育24小时，测定OD₆。
细菌细胞膜与基因组DNA损伤检测：
PI/DAPI染色：50 μg/mL OmLEAP-2处理3小时，激光共聚焦显微镜观察膜完整性。
扫描电镜：观察细菌形态变化。
DNA水解实验：不同浓度OmLEAP-2与细菌gDNA共孵育2小时，琼脂糖凝胶电泳检测。
OmLEAP-2在体内过表达：构建pEGFP-OmLEAP-2重组质粒，肌肉注射健康鱼。7天后检测肝脏OmLEAP-2表达，然后用嗜水气单胞菌攻击，监测24小时存活率、细菌负荷、铁含量和免疫因子表达。
铁含量与铁代谢基因检测：使用商业试剂盒检测血清和肝脏铁含量，RT-qPCR检测hepcidin和fpn1表达。
讨论与总结要点：
OmLEAP-2在各组织中广泛表达，以肝脏最高，与高等脊椎动物LEAP的保守表达模式一致。感染后OmLEAP-2在肝、脾、肠中显著上调，表明其在免疫应答中发挥重要作用。
OmLEAP-2对革兰氏阴性菌的抑制活性强于革兰氏阳性菌，这一特性与南极冰鱼、斑马鱼和北极茴鱼中的LEAP-2一致。其抗菌机制包括破坏细菌细胞膜完整性，使内容物泄漏，同时降解基因组DNA，阻断复制和感染建立。这种多机制作用在从七鳃鳗到人类的多种物种中保守存在。
OmLEAP-2过表达不仅直接杀灭细菌，还通过调节免疫因子增强宿主防御。感染前上调TNF-α和IL-1β，感染后抑制过度炎症反应，表明其兼具免疫增强和抗炎双向调节功能。
尽管LEAP-2通常不与铁代谢直接相关，但本研究发现OmLEAP-2过表达增加了肝脏铁含量，并上调了hepcidin和fpn1表达。结合斑马鱼中LEAP-2敲低会加速铁死亡的研究结果，提示OmLEAP-2可能通过激活宿主免疫应答和调控铁死亡通路间接影响铁稳态。
本研究鉴定并表征了多鳞白甲鱼LEAP-2基因OmLEAP-2。该基因编码92个氨基酸肽，具有两个二硫键和疏水表面。重组OmLEAP-2通过破坏细菌细胞膜和降解基因组DNA发挥广谱抗菌活性。体内过表达OmLEAP-2可降低细菌负荷、提高感染后存活率，并通过调节铁代谢、减少炎症和直接杀灭细菌来调控抗菌免疫。OmLEAP-2是增强鱼类免疫和促进水产养殖可持续发展的理想候选分子。
未来研究
1. 结构与功能优化
解析OmLEAP-2的NMR或晶体结构，明确关键活性位点。
通过截短或氨基酸替换设计更短、活性更强的衍生肽，降低生产成本。
2. 抗菌机制深化
明确OmLEAP-2识别和结合细菌细胞膜的具体受体或靶点。
研究其与抗生素联用的协同效应及抗生物被膜能力。
3. 铁代谢调控机制
阐明OmLEAP-2调控铁代谢的具体分子通路。
验证其是否通过影响铁死亡通路发挥抗菌和免疫调节作用。
4. 临床前应用开发
在更大规模鱼群中评估OmLEAP-2的体内安全性和有效性。
开发饲料添加剂或注射用制剂，推动产业化应用。
5. 物种普适性验证
检测OmLEAP-2对更多水产病原菌（如虹彩病毒、链球菌等）的抑制效果。
评估其在其他经济鱼类中的免疫调节和促生长作用。
6. 跨领域拓展
探索OmLEAP-2在哺乳动物（如小鼠）感染模型中的活性，评估其作为人用抗菌候选药物的潜力。
文献推荐
IF 7.7
YP-Ab-17206 Anti-GFP-tag rabbit antibody
YPE800053-H HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody
