WB 干货｜转印后膜上蛋白少甚至没有是咋回事？

你的蛋白，是在半路“失踪”了吗？

辛辛苦苦跑完电泳，小心翼翼完成转膜，满心期待地开始封闭——但丽春红染色后，膜上一片惨淡，只有零星几个可怜的条带，甚至干脆“光板”一块。

这种转膜后蛋白“神秘失踪”的惨案，是每个做Western Blot的人都可能遭遇的噩梦。它不像背景高或条带歪那样还能凑合看，它直接宣告了本次实验的“死刑”。

今天，我们就化身科研侦探，一起揭开蛋白在转膜途中“失踪”的谜团。

案发现场：蛋白到底去哪儿了？

首先，我们要建立排查思路。当转膜后膜上蛋白信号弱或无信号时，蛋白有三个可能的去向：

根本没跑出凝胶（电泳问题）

卡在转膜途中（凝胶→膜的转移失败）

穿膜而过，去了另一边（特别是小分子蛋白）

我们的任务，就是通过蛛丝马迹，锁定“真凶”。

第一现场：凝胶内的“滞留”

线索：转膜后，凝胶用考马斯亮蓝染色，发现蛋白大量残留在凝胶内，尤其是大分子量区域。

疑凶一：电泳环节就没跑好

电压/时间不当：蛋白尚未充分进入分离胶就停止了电泳

凝胶浓度过高：孔径太小，大分子蛋白被“卡住”

缓冲系统老化：pH值改变，影响蛋白迁移

排查与解决：
✅ 确保电泳时间充足，观察预染Marker是否跑开
✅ 根据目标蛋白分子量选择合适的凝胶浓度（如>100kDa用8%或更低）
✅ 使用新鲜配制的电泳缓冲液

疑凶二：凝胶自身问题

聚合不均：局部孔径异常，形成蛋白“路障”

过度聚合：凝胶太脆，转膜时易碎裂堵塞

排查与解决：
✅ 确保灌胶手法均匀，充分除尽气泡
✅ 控制APS/TEMED用量和聚合时间，避免凝胶过硬

第二现场：转移途中的“堵塞”

这是最常见的案发现场。蛋白离开了凝胶，却没能成功登陆膜。

线索：凝胶内蛋白残留不多，但膜上信号也很弱。转膜系统摸上去异常发热。

核心疑凶：转膜缓冲液体系问题

甲醇浓度是关键：

PVDF膜：需要10-20%甲醇。甲醇作用：①增加蛋白与膜的结合力；②防止蛋白在转移过程中重溶；③降低系统产热。

浓度过低 (<5%)：蛋白结合不牢，易丢失或穿透

浓度过高 (>20%)：凝胶过度收缩，孔径变小，大分子蛋白被“卡”

离子强度与pH：

缓冲液离子强度不足，导电性差，转移效率低下

pH值偏离最佳范围（通常Tris-甘氨酸系统pH~8.3），影响蛋白带电状态

排查与解决：
✅ 严格按配方配制转膜缓冲液，并记录每次的配制日期
✅ 对于>100kDa的大蛋白，可尝试将甲醇浓度降至10%，并加入0.1% SDS帮助其洗脱出凝胶
✅ 转膜缓冲液最好预冷后使用，或将其置于冰水浴中

次要疑凶：“三明治”组装错误
这是低级错误，但屡见不鲜！

膜与凝胶方向放反：蛋白跑向错误的方向

极性接反：膜在正极，凝胶在负极，蛋白往回跑

滤纸、凝胶、膜之间有气泡：气泡阻断局部电场，形成转移“空白区”

排查与解决：
✅ 牢记口诀：“黑对黑，白对白”（或遵循厂家说明）。凝胶面对膜，膜面对正极（通常为红色/阳极）。
✅ 组装时用玻璃棒仔细赶走每一层之间的气泡，从中心向四周滚动。

第三现场：成功登陆后的“逃离”

线索：转膜后短时间内（如丽春红染色）膜上有信号，但后续抗体检测时信号极弱。常见于小分子量蛋白(<20kDa)。

核心疑凶：蛋白结合不牢或穿透

膜类型选择错误：NC膜孔径过大（如用0.45μm检测10kDa蛋白），蛋白可能部分穿透。

转膜时间过长/电流过大：小蛋白被“强行”推过膜。

膜未充分活化（针对PVDF膜）：疏水表面未打开，蛋白结合容量低。

排查与解决：
✅ 检测小蛋白（<25kDa）请使用0.2μm孔径的NC膜或PVDF膜
✅ 优化转膜时间与电流：小蛋白用半干转或短时间湿转（如15-30分钟）
✅ PVDF膜必须用甲醇充分活化（浸湿至半透明）
✅ 对于极易穿透的小蛋白，转膜后可用0.5%戊二醛轻微固定（注意可能影响部分表位）

设备与环境：被忽视的“共犯”

疑凶一：电源输出不稳定

恒流转膜时，实际电流远低于设定值

电压/电流漂移

排查：用万用表直接测量转膜槽两端的电压/电流，与仪器显示值对比。

疑凶二：系统过热

湿转时缓冲液体积不足，或未在冰浴中进行

半干转仪热分布不均

解决：湿转务必使用足够缓冲液，并将整个转膜槽置于冰水混合物中。过热会导致蛋白变性聚集、凝胶熔化变形，彻底破坏转移。

神探的破案工具箱：系统性排查清单

下次遇到问题，请按此清单逐项核对：

转膜前

1. 预染Marker是否显示电泳正常？

2. 转膜缓冲液是否新鲜、冰冷？

3. PVDF膜是否用甲醇活化好了？

4. “三明治”各层顺序、方向、极性是否正确？

5. 气泡是否已全部赶走？

转膜中

1. 缓冲液是否完全覆盖并冰冷？

2. 设定电流/电压是否在合理范围？（湿转：0.2-0.4 A恒定电流）

3. 实际运行电流/电压是否与设定一致？

4. 系统是否异常发热？

转膜后（立即！）

1. 用丽春红或可逆染色剂染膜，直观评估转膜效率

2. 用考马斯亮蓝染凝胶，看蛋白残留情况
这两步是诊断问题的黄金标准！

从成功转膜到完美检测

当你终于通过系统排查，解决了转膜问题，在膜上看到了清晰的丽春红条带时，恭喜你，闯过了WB最关键的难关之一。但这只是成功的一半，后续的抗体孵育与检测同样至关重要。

一张承载了完整蛋白的膜，需要一个高特异性、高亲和力的抗体来精准识别目标，才能将生化信息转化为可见的条带。

正如优品WB抗体系列所秉持的理念：卓越的WB结果，源于每一环的可靠与精准。我们的产品专为助力攻克检测难关而设计：

✔ 高特异性——抗体经严格验证，条带清晰单一，背景干净，极大减少因抗体交叉反应导致的假阳性或背景干扰，让真实的转膜结果得到如实呈现。

✔ 高稳定性——精心优化的工艺确保抗体在4℃长期保存后活性依然稳定，反复使用信号衰减慢，保障您课题周期内数据的可比性与连续性。

✔ 多种包装规格——我们体贴地提供小包装（如10μL试用装），方便您在优化抗体浓度、进行预实验时使用，有效避免珍贵抗体的浪费。

✔ 覆盖全面——无论您需要的内参抗体（如GAPDH, β-actin）、各类磷酸化修饰抗体，还是那些难以寻觅的稀有靶点抗体，我们致力于提供一站式解决方案，为您的科研探索保驾护航。

记住，成功的Western Blot，是一场从样品制备、电泳分离、高效转印到精准检测的接力赛。每一棒都至关重要。

**愿您的下一次转膜，条带满载，信号清晰！欢迎关注我们，获取更多WB实战秘籍与解决方案。