做Western Blot的小伙伴们都知道，大分子量蛋白（200KD及以上）的检测简直就是一场噩梦。当你从SDS-PAGE转到NC/PVDF膜上，满怀期待地开始实验，结果却常常是——条带呢？我那么大的条带去哪了？

别急，今天我们就来聊聊大分子量蛋白WB实验的那些“坑”和填坑方法。

为什么大分子蛋白如此特殊？

简单来说，蛋白分子量越大，其在WB实验中的行为就越“不可预测”。

首先，大分子蛋白在细胞内的丰度通常较低，这就像在人群中找一个2米以上的高个子——本来就少。其次，它们的结构更为复杂，更多的二硫键、复杂的空间构象，使得它们在样品制备和电泳过程中更容易出现问题。

最重要的是，大分子蛋白在凝胶中的迁移率并非线性关系。在200KD以上，分子量的对数与迁移距离的关系曲线会变得平缓，这意味着微小的迁移距离差异就对应着巨大的分子量差异。

样品制备：一切从“温柔”开始

对待大分子蛋白，你得像对待初恋一样——既温柔又耐心。

裂解液选择：必须使用强效的裂解缓冲液！RIPA buffer是最低配置，对于核蛋白或膜蛋白，考虑使用含有SDS的裂解液。但要小心——SDS会影响后续的BCA定量，所以最好用Bradford法进行定量。

还原剂使用：β-巯基乙醇还是DTT？对于大分子蛋白，推荐使用新鲜配制的DTT，因为它的还原能力更强，能更有效地打开复杂的二硫键网络。

煮沸步骤：这是最容易被忽视的环节。对于200KD+的蛋白，不要煮沸5-10分钟！这会导致蛋白聚集、形成不溶性复合物。建议在95-100°C加热3-5分钟，或者对于特别敏感的蛋白，70-80°C加热10分钟。

*蛋白质样品制备流程

小贴士：在样品缓冲液中增加SDS的终浓度（可达4-5%），有助于更好地包裹大分子蛋白，防止聚集。

凝胶选择：门当户对很重要

选择正确的凝胶浓度对于大分子蛋白的分离至关重要。

梯度胶是首选：4-20%或4-12%的梯度胶能提供更好的分辨率和更清晰的条带。梯度胶的孔隙从上到下逐渐变小，使得不同大小的蛋白都能在适合自己的孔径中得到最佳分离。

单一浓度胶也可行：如果使用单一浓度胶，6%或8%的分离胶适合200KD以上的蛋白，但要注意电泳时间需要相应延长。

制备技巧：确保凝胶充分聚合（聚合时间不少于1小时），但也不要超过24小时使用，以免凝胶结构发生变化。

电泳条件：慢工出细活

对于大分子蛋白，电泳条件需要精细调整。

电压选择：高电压会导致发热，使蛋白条带弯曲，特别是对于大分子蛋白。建议使用恒压模式，电压不超过100V，当样品进入分离胶后，可适当增加至120-150V。

电泳时间：大分子蛋白迁移慢，需要更长的电泳时间。但时间过长会导致小分子蛋白跑出凝胶。解决方案是使用预染蛋白marker实时监控迁移情况。

缓冲系统：传统的Tris-甘氨酸系统对于200KD以上的蛋白分离效果有限。考虑使用Tris-乙酸系统，它的分离范围更广，特别适合大分子量蛋白。

电泳温度：最好在4°C冷室进行电泳，或者使用带冷却系统的电泳装置。高温会导致蛋白降解和条带扩散。

转膜：大分子蛋白的最大挑战

转膜是大分子蛋白WB中最容易失败的步骤！

膜的选择：PVDF膜对于大分子蛋白是必须的——它的机械强度更高，蛋白结合能力更强。使用前一定要在甲醇中活化至少1分钟。

转膜方式：湿转优于半干转！湿转能提供更均匀的电场和更好的散热，对于大分子蛋白的完整转移至关重要。

转膜缓冲液：推荐使用含SDS的转膜缓冲液（通常加入0.01-0.1% SDS），这有助于大分子蛋白从凝胶中洗脱。但同时要加入20%甲醇，防止SDS导致蛋白过度溶出。

转膜条件：对于200KD+蛋白，需要低电流长时间转膜。建议使用200-250mA恒定电流，转膜时间至少16小时（过夜）。如果想缩短时间，可以提高电流但必须确保良好的冷却——将转膜槽置于冰水混合物中。

转膜方向：这是一个小技巧但很有效——确保膜在凝胶的正极侧，蛋白从凝胶向膜迁移是“ downhill”过程。

抗体孵育：给大分子一点空间

封闭：使用5% BSA或脱脂牛奶在室温下封闭1小时，或者4°C过夜。对于磷酸化蛋白，BSA是更好的选择。

一抗孵育：建议在4°C缓慢孵育过夜，这有助于抗体更好地结合到大分子蛋白的表位上。

洗涤：增加洗涤时间和次数——每次5-10分钟，洗涤4-5次。大分子蛋白可能产生非特异性结合，需要更彻底的洗涤。

常见问题及解决方案

问题1：无信号
可能原因：转膜不完全；抗体无法识别变性表位
解决方案：使用可逆染色剂（如Ponceau S）确认转膜效率；尝试不同克隆号的抗体

问题2：条带在凝胶底部堆积
可能原因：蛋白未充分溶解；分子量标准不准确
解决方案：优化裂解缓冲液；使用预染蛋白marker

问题3：条带弥散
可能原因：凝胶聚合不均匀；电泳温度过高
解决方案：确保凝胶新鲜制备；在冷室进行电泳

问题4：高背景
可能原因：封闭不充分；洗涤不彻底
解决方案：优化封闭条件；增加洗涤次数和时间

进阶技巧：验证你的结果

当你终于看到条带时，别忘了验证它确实是你想要的蛋白：

1. 使用siRNA敲低目标蛋白，确认条带消失或减弱

2. 使用过表达系统，确认条带增强

3. 尝试不同来源的抗体，看是否能得到一致的結果

4. 对于已知有修饰的蛋白，使用相应的酶处理（如磷酸酶）

写在最后

大分子量蛋白的WB实验确实充满挑战，但通过系统优化每个步骤，完全可以获得漂亮、可重复的结果。记住，耐心和注意力细节是成功的关键。

说到WB实验的每一个细节，选择合适的试剂与解决方案同样重要。在优品WB，我们深知大分子蛋白WB的痛点，专门优化了一系列高品质WB相关产品，从高效的裂解液到高结合能力的PVDF膜，从灵敏的ECL底物到精准的分子量标准，都为帮助科研工作者攻克200KD+蛋白的检测难题而设计。

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