发布时间：2025-04-23
你有没有想过，为什么每次Western Blot实验都逃不过那条“内参”的身影？你是否经历过WB结果像开盲盒的崩溃时刻？今天就来扒一扒这个实验界的“隐藏款神器”—内参。
什么是内参？
内参是指一种高表达或广泛表达的蛋白，且在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为 WB 技术分析蛋白水平的标准化参考。
内参的作用
校正蛋白样品定量以及上样过程中的误差，保证实验结果的准确性。
作为空白对照，检测WB过程中蛋白转膜是否完全以及发光显色体系是否正常。
内参的作用
Western blot除了能证明某样品含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。
然而如果仅将蛋白浓度测定作相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法，显然是不可取的。
首先各种蛋白质浓度定量方法都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。
如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。
BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford法敏感度最高，且与一些列干扰Lowry、BCA反应的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相溶，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
内参怎么选择呢
（1）根据样本的种属来源选择，如哺乳动物或者植物等。
（2）考虑目的蛋白的分子量大小，一般需要与目的蛋白的分子量相差5kd以上。
（3）根据蛋白表达位置选择不同的内参，不同的细胞器中选择的内参也不同。
内参不是可有可无的摆设，而是实验成功的“定海神针”！它帮你校准误差、验证系统、让数据更有说服力。内参的选择直接影响实验结果的可信度，因此，高特异性、高稳定性的优质内参抗体至关重要！
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