摘要：

目的：甲氨蝶呤（MTX）诱导的肺纤维化具有较高的发病率和死亡率，目前治疗选择有限。本研究探讨双硫仑（DSF）是否能减轻MTX诱导的肺纤维化，并探索其潜在机制。

方法：将8周龄雄性小鼠分为对照组、DSF组、MTX组和MTX+DSF组，治疗8周。监测体重、食物和水的摄入量。治疗后，通过HE染色、Masson染色和电子显微镜分析肺组织。采用实时定量PCR和ELISA评估肺组织和血清中IL-1β和TNF-α等炎症标志物。通过PCR、ELISA和Western blot检测纤维化标志物，包括Col1α1、α-SMA和羟脯氨酸。将2型肺泡上皮细胞系MLE12细胞分为相似的四组，进行RNA测序和生物信息学分析，以阐明DSF抗MTX诱导肺纤维化的机制。采用ELISA和Western blot检测E-cadherin和α-SMA的表达。

结果： DSF显著减轻了MTX诱导的肺泡间隔增厚、肺纤维化和炎症细胞浸润。DSF还降低了炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，以及Col1α1、α-SMA等的表达。RNA-seq显示，DSF诱导了与肺纤维化相关的多个信号通路的变化，特别是细胞外基质相关基因。ELISA和Western blot显示，MTX组E-cadherin表达下降，α-SMA表达增加，而DSF治疗部分逆转了这些变化。

结论： DSF通过减少2型肺泡上皮细胞的上皮-间质转化（EMT）来减轻MTX诱导的肺纤维化。双硫仑显示出作为MTX诱导肺纤维化治疗药物的潜力。

关键词： 双硫仑；甲氨蝶呤；肺纤维化；上皮-间质转化；2型肺泡上皮细胞

核心内容：

动物实验：8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为四组：对照组、DSF组、MTX组、MTX+DSF组，每组5只。MTX通过饮水给予（持续8周），DSF（30 mg/kg/天）在最后4周通过口服给予。监测体重、食物和饮水摄入。实验结束后收集血清和肺组织，进行HE染色、Masson染色和电子显微镜观察。

细胞实验：小鼠2型肺泡上皮细胞系MLE12分为四组：对照组（DMSO）、DSF组（20 μM）、MTX组（4 mM）、MTX+DSF组（4 mM MTX + 20 μM DSF）。处理48小时后，收集细胞用于mRNA或蛋白提取，并进行RNA测序。

检测方法：采用qPCR、Western blot、ELISA检测炎症因子（IL-1β、TNF-α）、纤维化标志物（Col1α1、α-SMA、羟脯氨酸、Vimentin、TGF-β1）以及EMT标志物（E-cadherin、α-SMA）。RNA-seq数据进行了GO和KEGG通路富集分析。

研究流程示例：

DSF减轻MTX诱导的肺纤维化和炎症：

MTX组小鼠体重显著下降，肺泡间隔增厚，炎症细胞浸润，胶原纤维沉积明显；而MTX+DSF组上述病理变化显著减轻。

电子显微镜显示，MTX组2型肺泡上皮细胞（富含板层小体）显著增生，胶原纤维沉积增加；DSF联合治疗后，这些指标显著下降。

MTX组肺组织和血清中IL-1β、TNF-α、Col1α1、α-SMA、Vimentin、TGF-β1及羟脯氨酸水平显著升高，DSF联合治疗组这些指标显著降低。

RNA-seq揭示DSF调控多条信号通路：

比较MTX组与MTX+DSF组，共发现569个差异表达基因（184个上调，385个下调）。

KEGG分析显示，DSF影响了PI3K-Akt、MAPK、Ras、ECM-受体相互作用、黏着斑、ErbB、谷胱甘肽代谢等多个信号通路，这些通路与肺纤维化密切相关。

热图分析显示，DSF显著下调了MTX诱导的多种细胞外基质基因（如Col4α3、Col6α1、Itgb3等）的表达。

DSF抑制2型肺泡上皮细胞的上皮-间质转化（EMT）：

MTX组中E-cadherin（EMT标志物）表达显著下降，α-SMA表达升高；而MTX+DSF组中E-cadherin表达恢复，α-SMA表达下降。

在肺组织和MLE12细胞中均观察到上述变化，表明DSF通过抑制EMT减轻肺纤维化。

讨论与总结要点：

本研究首次证明DSF可减轻MTX诱导的肺纤维化，表现为肺泡壁厚度减少、胶原沉积减轻、炎症细胞浸润减少及相关炎症和纤维化因子表达下调。

DSF的作用机制复杂，涉及多条信号通路（如PI3K-Akt、MAPK、ECM-受体相互作用等），这些通路在博来霉素或其他原因诱导的肺纤维化中也有报道，提示DSF可能具有广谱抗纤维化潜力。

2型肺泡上皮细胞在肺损伤后可增殖分化为1型肺泡上皮细胞，但也可发生EMT转化为产生胶原的肌成纤维细胞，是肺纤维化的重要细胞来源。本研究表明，DSF通过抑制MTX诱导的EMT，减少了细胞外基质的过度沉积。

研究局限性：由于时间和条件限制，未能深入验证所有信号通路，未来需要更系统、全面的研究。

未来研究方向

1、深入验证关键信号通路
重点验证RNA-seq筛选出的PI3K-Akt、MAPK、ECM-受体相互作用等通路在DSF抗纤维化中的具体作用机制。

2、开展DSF的体内最佳给药方案研究
探索不同剂量、给药途径和疗程对MTX诱导肺纤维化的疗效及安全性。

3、评估DSF对其他药物所致肺纤维化的保护作用
拓展研究DSF是否对博来霉素、胺碘酮等其他药物引起的肺纤维化同样有效。

4、探索DSF对EMT过程的上游调控分子
进一步明确DSF是通过哪个或哪些转录因子或表观遗传机制抑制EMT。

5、开展临床前或早期临床研究
在MTX治疗的患者中观察联用DSF能否降低肺纤维化发生率及严重程度。

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IF 4.6

文章标题

Topical hADSCs-HA Gel Promotes Skin Regeneration and Angiogenesis in Pressure Ulcers by Paracrine Activating PPARβ/δ Pathway

作者：

Wu Xiaohui, Xu Hong, Zhang Zhaohua, Ma Ziyi, Zhang Linyi, Wang Chunyang, Lan Kai, Li Rong, Chen Min

DOI：

10.1007/s00408-024-00764-5

发表期刊：

LUNG

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