发布时间：2025-07-09
做Western Blot（WB）的小伙伴们，可能都遇到过这样的灵魂拷问：“细胞上清液里的蛋白能用WB检测吗？”
有人说：“当然可以！我做过！”
也有人摇头：“不行，信号太弱，结果不可靠。”
那到底行不行？今天咱们就来掰扯清楚，顺便聊聊怎么让实验结果更靠谱！
细胞上清液，简单来说就是细胞培养一段时间后，去掉细胞剩下的液体。这里面可能包含：
细胞主动分泌的蛋白（比如细胞因子、激素、外泌体等）
细胞被动释放的蛋白（比如细胞损伤或死亡后漏出来的胞内蛋白）
培养基里的血清蛋白（如果用的是含血清培养基，比如10% FBS，里面会有大量牛血清蛋白）所以，WB能不能检测到目标蛋白，首先得看它是不是真的存在于上清液里！
细胞分泌的蛋白量通常远低于胞内蛋白，比如某些细胞因子可能只有pg/mL级别，而WB的检测下限一般在ng级别。直接跑WB？很可能啥也看不见！
解决方案：
✅ 浓缩上清液——超滤离心、丙酮/TCA沉淀、冻干浓缩等
✅ 提高上清液体积（比如收集更多培养液）
✅ 选择高灵敏度抗体（推荐用化学发光法，别用肉眼可见的显色法）
如果培养基里含血清（比如10% FBS），上清液里会混入大量牛血清蛋白（BSA、IgG等），它们可能在WB里形成高背景，甚至和目标蛋白分子量接近，导致条带分不清。
解决方案：
✅ 换用无血清培养基（比如Opti-MEM、SFM）
✅ 提前饥饿处理细胞（用无血清培养基培养几小时，减少血清蛋白干扰）
✅ 跑WB前用BSA封闭，减少非特异结合
上清液里的蛋白没有细胞保护，更容易被蛋白酶降解。如果你收完上清液放4°C隔夜再测，可能目标蛋白早就被分解得渣都不剩了……
解决方案：
✅ 收上清液后立刻加蛋白酶抑制剂（如PMSF、cocktail）
✅ 尽快处理样本，避免反复冻融
✅ 低温保存（-80°C），减少降解
如果你不确定目标蛋白是否真的分泌到上清液里，可以先做个胞内WB，确认细胞确实表达这个蛋白。然后再对比上清液，看看是否能检测到。
空白培养基对照（排除血清干扰）
细胞裂解液对照（确认抗体能结合目标蛋白）
敲除/敲低细胞对照（如果可能，用CRISPR或siRNA敲除目标基因，看看上清液条带是否消失）
降低抗体稀释度（比如1:500→1:200）
延长曝光时间（但要注意背景信号）
✅ 可以测，但要看目标蛋白的表达水平（高分泌蛋白如IL-6、TNF-α相对容易，低丰度蛋白可能测不到）
✅ 必须优化实验条件（浓缩样本、减少干扰、防止降解）
✅ 对照实验一定要做，否则结果可能只是“美丽的误会”
其实，有时候不是实验方案不行，而是抗体不够给力！
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